MEDIOS PARA CULTIVO DE HONGOS

Al formular un medio de cultivo cualquiera para los hongos, ya sea solido o liquido, el objetivo consiste en proporcionar una mezcla de los nutrientes requeridos, en concentraciones que promueven el crecimiento de un organismo específico e inhiben el crecimiento de organismos contaminantes.

Cuando se desean separar contaminantes se eligen medios de cultivo sólidos, ya que la superficie plana produce un patrón de crecimiento bidimensional, permitiendo examinar el medio fácilmente y separar el organismo de cualquier contaminante.
Como agente gelificante de los medios de cultivo se utiliza comúnmente el agar, es un polisacárido obtenido de las algas que no es nutriente para la mayoría de los microorganismos. El agar es firme a temperaturas de incubación pero se convierte en líquido cuando se calienta a la temperatura de ebullición del agua, gelificando nuevamente cuando enfría a 45°C.

ADITIVOS EN MEDIOS DE CULTIVO PARA HONGOS

Se añaden antibacterianos para inhibir el crecimiento de bacterias saprofitas que suelen contaminar los cultivos; los más usados son el succinato sódico de cloranfenicol¹ y la gentamicina. El agua oxigenada también se utiliza para inhibir el crecimiento de contaminantes, es efectivo contra esporas de hongos y contra bacterias, pero no es efectivo contra el micelio de hongos contaminantes.

Gentamicina 0.04 gr/lt.
Cloranfenicol 0.4 gr/lt.
Tetraciclina 0.1gr/lt.
Bencilpenicilina 0.1 gr/lt.
Agua oxigenada 8ml/lt.²

MEDIO DE AGAR, PAPA, SACAROSA Y LEVADURA

El medio preferido de Hongos Prehispanicos





Ingredientes para 10 cajas petri aprox.

Ingredientes:
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Papa con cascara 50.0 g
Miel 5.0 g
Agar 4.5 g
Agua embotellada 250.0 ml
Agua oxigenada 2.0 ml
Levadura en polvo 0.5 g

Materiales:
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10 Cajas petri esterilizadas
1 Frasco de vidrio de 500 ml.
1 Trozo de tela nuevo o limpio
Jeringa nueva o esterilizada
Algodón
Papel aluminio

Rebanar en hojuelas la papa o rayarla, ponerla a cocer en 250 ml. de agua por 20 minutos; al pasar los 20 minutos filtrar la papa con ayuda de algún trozo de tela limpio y reponer el agua que se ha perdido.
Agregar la miel, la levadura y el agar en polvo, hervir nuevamente hasta disolver completamente el agar; una vez disuelto, verter la solución en el frasco y reponer nuevamente el agua perdida hasta completar los 250 ml.³
Tapar el frasco con una bola de algodón, luego cubrir la boca del frasco hasta el cuello con papel aluminio.
Esterilizar en olla de presión 15 minutos, nunca más de 45 minutos para evitar la caramelización del azúcar o el agar; ya que los hongos no crecen en caramelo.
Si el agar se usará para germinar esporas se puede proceder a llenar las cajas petri; pero si el agar se usará para colocar micelio o tejidos de una seta, habrá que agregar 2ml. de agua oxigenada⁴ cuando la solución enfríe a 55°C osea cuando al tocar el frasco con el dorso de la mano se siente caliente pero no quema.
El agua oxigenada se toma con ayuda de la jeringa y se inyecta a través del tapón de algodón; cuidando de que la aguja atraviese completamente el algodón y que el agua baje lentamente por las paredes del frasco, evitando hacer burbujas; ya mezclada el agua oxigenada con el agar, se podrá comenzar a llenar cajas petri.

OTROS MEDIOS DE CULTIVO

PAPA-DEXTROSA AGAR (PDA)⁵

Ingredientes
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Glucosa 20.0 g
Extracto de papa 4.0 g
Agar 15.0 g
Agua 1.0 lt
pH 5.6
Ajustar el pH.
Calentar a ebullición durante 1 minuto.
Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos.
Distribuir el medio en volúmenes de 25 ml en cajas petri en condiciones asépticas.

PAPA-DEXTROSA AGAR (PDA)⁶

Es un medio muy usado, sirve para aislar todo tipo de hongos; los hongos parásitos de insectos, los hongos parásitos de plantas y los hongos saprofitos crecen muy bien y esporulan en este medio.

Ingredientes:
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Papa sin cascara 200 g
Dextrosa 10 g
Agar 18 g
Agua destilada 1 lt

Procedimiento

Lavar las papas, cortarlas y hacerlas hervir en un litro de agua destilada por 20 minutos, remover las papas; disolver en el líquido la dextrosa y el agar. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 15 libras de presión.

AGAR PAPA SACAROSA⁷

Ingredientes
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Papa 200.0 g
Sacarosa 20.0 g
Sulfato de amonio 1.0 g
Cloranfenicol 0.4 g
Agar 15.0 g
Agua destilada 1.0 lt
Medio 3⁸

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Agua 1.0 lt
Peptona de soja 10.0 g
Glucosa 10.0 g
Extracto de levadura 2.5 g
Agar 15.0 g

AGAR CON EXTRACTO DE MALTA Y LEVADURA (MYA)⁹

Ingredientes
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Agar 22.00 g
Extracto de malta 12.00 g
Extracto de levadura 1.00 g
Harina orgánica[10] 1.00 g.
Aserrín 5.00 g
Agua 1.00 lt

Vertir todos los ingredientes secos en un frasco, seguidos por el agua; asegúrese de usar un frasco que sea 1.5 o 2 veces el volumen del medio preparado.
Aplique un tapón de algodón al frasco, y forre la boca del frasco junto con el algodón usando papel aluminio.
Coloque el frasco en el autoclave, junto con la cantidad necesaria de agua.
Esterilizar a 121°C de 15 a 30 minutos, nunca más de 45 minutos ya que los azúcares caramelizan y los hongos no crecen en azúcar caramelizada.
Permite al autoclave alcanzar la presión atmosférica, entonces mueve el frasco dentro el “Glove Box” (caja con guantes).
Si se planea usar peroxido de hidrogeno agregar en este momento 8 ml de h2o2 al 3%, usando una pipeta esterilizada, tratando de no crear burbujas.
Vertir en las cajas petri.

MEDIO DE AGAR-MALTOSA

Ingredientes
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20 gr de agar
2 gr de levadura por litro

Tanto el agar como el extracto de malta se disuelven por separado en agua, antes de juntarse. Como el medio resultante es ácido se puede rebajar con una solución alcalina, por ejemplo de sosa, si es necesario. Hay quien prepara este medio de cultivo añadiendo a un litro de solución 2 gr de levadura.¹¹

MEDIO SABOURAUD CON CLORANFENICOL Y GENTAMICINA (S AB G+C / S AB HI G+C)

Es el medio SAB clásico con la incorporación de los antibióticos Gentamicina y Cloranfenicol, que permiten el crecimiento de casi todos los hongos filamentosos y levaduras al mismo tiempo que inhiben a una gran mayoría de bacterias. Se utiliza en tubo o en placa

AGAR PAPA SACAROSA O GLUCOSA¹²

Ingredientes
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Papa 250.0 g
Glucosa o Sacarosa 20.0 g
Agar 20.0 g
Agua 1.0 lt

Procedimiento

Se rallan la papa con cáscara y se agrega el agua, se hierve por 45 minutos; luego se filtra por gasa, entonces se agregan 20 gr de glucosa o sacarosa junto con 20 gramos de agar y se agrega agua hasta volver a completar 1 lt. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121°C.

MEDIOS PARA EL CULTIVO DE MICORRIZAS

Más complicados son otros medios ricos que pueden emplearse para el cultivo puro de hongos formadores de micorrizas, por ejemplo el siguiente:

Ingredientes:
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Agua 1lt.
Agar 15g
Glucosa 10g
Maltosa 5g
Fosfato monopotasico 0.5g
Sulfato magnésico hidratado 0.5g
Cloruro férrico al 1% 1ml.
Tiamina 60 ug
Peptona 1g

MEDIOS PARA AISLAMIENTOS ESPECIALES¹³

MEDIO DE PATATA

Se prepara con pulpa de patata como base y, al ser un medio muy pobre, se utiliza para estimular el desarrollo in vitro de las estructuras de reproducción sexual de la mayor parte de los hongos. También estimula la producción de pigmentos en hongos como por ejemplo, T. rubrum . Se puede añadir zanahoria y bilis (para favorecer la obtención de clamidosporas de Candida albicans ) o glucosa/dextrosa (para diferenciar T richophyton rubrum )

MEDIO DE ARROZ

Medio a base de granos de arroz blanco que se utiliza para diferenciar Microsporum auduinii (que no se desarrolla en este medio) de otras especies de Microsporum

MEDIO DE CZAPEK

Se utiliza para estimular las características diferenciales de Aspergillus spp y para estimular la fermentación de Sporothrix schenckii

MEDIO DE ALPISTE

Es el medio indicado para detección de Criptococcus neoformans. Esta levadura es la única conocida actualmente, de interés clínico, que produce la enzima fenoloxidasa. El ágar de Alpiste contiene sustratos para esta enzima por lo que el crecimiento de Criptoccus se detecta por la formación de colonias de color pardo.

MEDIO CROMAGAR CANDIDA

Es un medio diferencial que permite la identificación presuntiva de algunas especies habituales de Candida en función del color y morfología que adoptan cuando crecen en este medio. Puede utilizarse como medio para aislamiento primario.

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¹ El palmitato de cloranfenicol se deteriora paulatinamente con la acción del calor; el succinato sódico de cloranfenicol es resistente a temperaturas de esterilización del autoclave.
² Agregar el antibiótico elegido cuando el medio enfríe a 50°C; debe ir diluido en 10 ml de agua estéril, excepto el agua oxigenada que debe ir sin diluir.
³ En este punto el autor recomienda dejar reposar el agar 24 horas y volver a fundir el agar, para que las esporas bacterianas germinen y se facilite la esterilización en olla de presión casera, pero se puede omitir esta recomendación y continuar.
⁴ EL agua oxigenada mata esporas y bacterias, pero los tejidos vivos como el micelio pueden descomponer el agua oxigenada en agua y oxígeno mediante la acción enzimática.
⁵ AQUIAHUATL RAMOS, María; PEREZ CHABELA, María. (2004) "Manual de prácticas del laboratorio de microbiología general" México:Universidad Autónoma Metropolitana ISBN 970-31-0141-0
⁶ CAÑEDO, Veronica. AMES, Teresa (2004) "Manual de laboratorio para el manejo de hongos entomopatogenos" Lima:Centro internacional de la papa. ISBN 92-9060-238-4
⁷ Receta encontrada sin instrucciones, y en un documento sin título, al parecer era un fragmento de una tesis.
⁸ CARRILLO, Leonor (2003) "Microbiología Agrícola" Argentina: Universidad Nacional de Salta ISBN 987-9381-16-5
⁹ OGAMË Kerry, NICHOLAS, L.G. (2006) "Psilocybin mushroom handbook" U.S.A.:Quick Trading American ISBN-13: 978-0932-55171-9 ISBN: 0-932551-71-8
¹⁰ Harina orgánica de cualquier grano: arroz, trigo, cebada, avena, etc...
¹¹ GARCIÁ ROLLÁN, Mariano. (2007) "Cultivo de setas y trufas" (5ed) Madrid: Ediciones Mundi-Prensa ISBN13: 978-84-8476-316-1
¹² CARRILLO, Leonor (2003) "Los hongos de los alimentos y forrajes" Argentina: Universidad Nacional de Salta.
¹³ GARCIA CANO, Dulce María (2006) “Microbiología de los alimentos: Medios de Cultivo" México:Colegio Tolteca.

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